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川芎为伞形科植物川芎的面法干燥根茎,性味辛温,优化氧化研究归肝、川芎胆、蛋白心包经,工艺具活血行气、及抗祛风止痛的活性功效。首载于《神农本草经》,面法为著名的优化氧化研究川产道地药材。目前对川芎所含成分的川芎研究,主要集中于小分子成分,蛋白对川芎大分子成分的工艺研究甚少。前期研究初步表明,及抗川芎中含有丰富的活性蛋白质,且具有较好的面法抗氧化能力。天然蛋白质因其来源丰富、可生物降解、环境友好性和高生物活性等特点,近年来成为天然抗氧化剂的研究热点。
氧自由基对生物大分子、氨基酸、DNA、脂类和蛋白质等造成氧化损伤且与癌症、动脉粥样硬化、冠心病、糖尿病、神经功能障碍和免疫系统减弱等慢性疾病的发生有关。经研究发现,植物源蛋白质具有抗凝血、抗肿瘤、抗氧化和抗真菌等生物活性,如石斛蛋白提取液、葛根蛋白、豌豆蛋白、黑豆蛋白等均具有较好的抗氧化活性,对羟基自由基和DPPH自由基有良好的清除效果,大豆蛋白具有较强的DPPH自由基清除能力。目前,川芎蛋白(LCP)抗氧化能力的相关研究未见报道,本研究旨在通过Box-Behnken响应面法确定其最佳提取条件;以DPPH自由基清除、羟自由基清除和超氧阴离子自由基清除率为指标,以抗坏血酸为阳性对照进行分析,考察LCP的抗氧化活性,同时为LCP的开发提供可靠的数据资料。
川芎,贵阳济仁堂药业有限公司;BCA蛋白浓度测定试剂盒、考马斯亮蓝R250、十二烷基硫酸钠、Maker、抗坏血酸标准品(VC)北京索莱宝科技有限公司;DPPH自由基清除能力试剂盒、羟自由基清除能力试剂盒、超氧阴离子清除能力试剂盒 苏州格锐思生物科技有限公司。
PHS-3CpH计,上海仪电科学仪器股份有限公司;TU-1810紫外分光光度计,北京普析通用仪器有限责任公司;AL204电子天平,美国梅特勒托利多公司;FD冷冻干燥机,上海拓纷机械设备有限公司;MultiskanFC酶标仪,赛默飞(上海)世尔仪器有限公司。
分别吸取5mg/mL的标准溶液4、6、8、10、12、14、16、18、20μL于96孔板中,并用蒸馏水补足至20μL。分别加入200μLBCA工作液(BCA试剂与铜试液50:1)混匀,室温静置l0min,于650nm下检测不同浓度牛血清蛋白溶液的吸光值A,以蛋白质量浓度为横坐标,吸光值为纵坐标绘制标准曲线,回归方程为:y=2.2706x+0.0402(R2=0.9993)。川芎提取物中LCP浓度根据上述回归方程求得。
基于前期研究,以LCP得率为检测指标,分别以pH、提取时间、料液比为影响因素以设计单因素实验。
取干燥洁净的川芎药材,粉碎,过3号筛(50目)。称取适量过筛后的川芎药材粉末置于圆底烧瓶中,加4倍量沸程为30~60℃石油醚水浴回流脱脂1h,静置后过滤,将川芎药材粉末于通风橱自然晾干,备用。
精密称取川芎药材粉末3g,平行三份,加入Tris-HCl(68mmol/L,0.5%SDS,5%甘油,10%β-巯基乙醇)溶液,置于4℃冰箱浸提1.5h。5000r/min离心10min,收集上清,加入3倍量10%TCA-丙酮,置−20℃冰箱沉淀1.5h,5000r/min离心10min,收集沉淀,分别用丙酮及80%丙酮洗涤3次,5000r/min离心10min,收集沉淀,冷冻干燥即得LCP,按公式(1)计算得率。
式中:M1表示川芎蛋白冻干粉的质量,g;M2表示川芎药材的质量,g。
按“1.2.2.2”项下操作,固定提取时间为1.5h,料液比为1:15g/mL,研究提取液pH(3、4、5、6、7、8、9)对LCP得率的影响。
按“1.2.2.2”项下操作,固定提取时间为1.5h,料液比为1:15g/mL,研究提取液pH(3、4、5、6、7、8、9)对LCP得率的影响。
按“1.2.2.2”项下操作,固定提取时间为1.5h,提取液pH为6,研究料液比(1:10、1:15、1:20、1:25、1:30g/mL)对LCP得率的影响。
按“1.2.2.2”项下操作,固定料液比为1:20g/mL,提取液pH为6,研究提取时间(0.5、1、1.5、2、2.5h)对LCP得率的影响。
为选择最佳实验条件,以A(提取时间h)、B(料液比g/mL)、C(提取溶剂pH)为独立变量,蛋白得率为响应变量,采用DesignExport8.0.6的Box-Behnken响应面方法(RSM)优化过程。各组平行3次,因素和水平见表1。
采用贺小燕等试验方法,以4.5%的浓缩胶和12.5%的分离凝胶进行SDS-PAGE电泳,浓缩胶电压80V电泳20min,分离胶电泳120V电泳80min,指示剂到达分离胶底部约1cm处停止电泳,考马斯亮蓝R250染色,脱色液脱色至条带清晰。
取10支洁净离心管,称重。根据表2,分别加入不同体积LCP溶液(50mg/mL),再分别加入不同浓度、不同体积的乙酸溶液或去离子水,混合,测定pH。于4℃静置1h后,5000r/min离心15min。完全除去上清液后,将带有沉淀物的离心管称重,通过减重法计算沉淀质量。由于蛋白质在pI处沉淀最多,即可测定川芎的pI。
将50mg样品悬浮在10mL蒸馏水中,并使用1mol/mL的HCl或NaOH溶液将悬浮液的pH调节至2~12。将悬浮液在22℃下连续搅拌1h,并在5000r/min离心15min,BCA试剂盒测定上清液中蛋白质的量。溶解度按公式(2)计算。
式中:M1:悬浮液中加入的蛋白总量,mg,M2:离心后上清液蛋白的量,mg。
取不同浓度的LCP溶液各0.125mL,按试剂盒加入反应试剂一、试剂二、试剂三各0.125mL和0.5mL的蒸馏水,混匀,即为测定组。取等体积蒸馏水,依法制备空白组。取不同浓度的LCP溶液液各0.125mL,加入反应试剂一、试剂二各0.125mL和0.625mL的蒸馏水,混匀,即为对照组。于37℃反应20min,转移至玻璃比色皿中,蒸馏水调零,510nm读取各组吸光度值A,平行测定3次,以VC为阳性对照组,公式(3)计算清除率。
式中:A1:空白组吸光度值,A2:测定组吸光度值,A3:对照组吸光度值。
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